显微镜的种类及使用

一、光学显微镜

光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。普通光学显微镜通常能将物体放大 1500～2000 倍(zui大的分辨力为 0.2μm)。

（一）光学显微镜的基本结构（附图1）

1．光学部分 包括目镜、物镜、聚光器和光源等。

（1）目镜 通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。在目镜上方刻有放大倍数，如 10×、20×等。按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。

（2）物镜 由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：①低倍物镜：指 1×～6×；
            ②中倍物镜：指 6×～25×；
            ③高倍物镜：指 25×～63×；④油浸物镜：指 90×～100×。
     其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为 1.5 左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。其他物镜则直接使用。观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。

（3）聚光器 由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到*成像效果。

（4）光源 较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成。不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，一般都用平面镜。新近出产的显微镜一般直接在镜座上安装光源，并有电流调节螺旋，用于调节光照强度。光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。

        显微镜的光源照明方法分为两种：透射型与反射(落射)型。前者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。

2. 机械部分 包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。
（1）镜座 基座部分，用于支持整台显微镜的平稳。
（2）镜柱 镜座与镜臂之间的直立短柱，起连接和支持的作用。
（3）镜臂 显微镜后方的弓形部分，是移动显微镜时握持的部位。有的显微镜在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节镜筒向后倾斜的角度，便于观察。
（4）镜筒 安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连目镜，下连接物镜转换器。显微镜的标准筒长为 160 mm，此数字标在物镜的外壳上。
（5）物镜转换器 镜筒下端的可自由旋转的圆盘，用于安装物镜。观察时通过转动转换器来调换不同倍数的物镜。
（6）载物台 镜筒下方的平台，中央有一圆形的通光孔。用于放置载玻片。载物台上装有固定标本的弹簧夹，一侧有推进器，可移动标本的位置。有些推动器上还附有刻度，可直接计算标本移动的距离以及确定标本的位置。
（7）准焦螺旋 装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋，转动时可使镜筒或载物台上下移动，从而调节成像系统的焦距。大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，镜筒升降 10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使镜筒仅升降 0.1mm。一般在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之位于视野中。在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。必须注意，一般显微镜装有左右两套准焦螺旋，作用相同，但切勿两手同时转动两侧的螺旋，防止因双手力量不均产生扭力，导致螺旋滑丝。

（二）普通光学显微镜的基本成像原理

光线→（反光镜）→遮光器→通光孔→镜检样品（透明）→物镜的透镜（*次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再次放大成虚像）→眼。

（三）普通光学显微镜的使用过程

1．镜检前的准备 室内应清洁而干燥，实验台台面水平，稳固无震动，显微镜附近不应放置腐蚀性的试剂。从显微镜柜或镜箱内取出显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地取出，放置在实验台桌面上，置于操作者左前方，距实验台边缘约10cm，镜臂朝自己，镜筒朝前。实验台右侧放绘图用具。

2．调节光源 如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的灯光。直射的太阳光会对观察者的眼睛造成伤害。转动转换器，使低倍镜正对通光孔，将聚光器上的虹彩光圈开到zui大，观察目镜中视野亮度，同时调节反光镜角度，使光照达到zui明亮zui均匀。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照的强弱。

3．装置待检玻片 将待观察的样品制作成临时或*装片，放在载物台上，用弹簧夹固定，有盖玻片的一面朝上。移动推进器，调节待检样品至通光孔的中心。

4．低倍镜观察 将低倍镜对准通光孔，缓缓转动粗准焦螺旋，将物镜与装片的距离调至zui近。注意不要压碎盖玻片。通过目镜观察，同时用粗准焦螺旋缓慢调节，直至物像出现，再用细准焦螺旋微调，同时调节光源亮度与虹彩光圈的大小，使物像达到zui清晰的程度。并利用推进器把需要进一步放大观察的部分移至视野中央。如果使用双筒目镜，应在观察前先调整双筒距离，使两眼视场合并。

5．高 倍镜观察 转动转换器，选 择较高倍数的物镜，用 细准焦螺旋调节焦距，到 物像清晰为止。

6．油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在 0.2 mm 以内，且一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时，调焦速度必须放慢，避免压碎玻片，并使物镜受损。
（1）在低倍镜下找到观察目标，中、高倍镜下逐步放大，将待观察部位置于视野中央，调节光源和虹彩光圈，使通过聚光器的光亮达到zui大。
（2）转动粗准焦螺旋，将镜筒上旋（或将载物台下降）约 2 cm，加一小滴香柏油于玻片的镜检部位上。
（3）将 粗准焦螺旋缓缓转回，同 时注意从侧面观察，直 至油镜浸入油滴，镜 头几乎与标本接触。
（4）从目镜中观察，用细准焦螺旋微调，直至物象清晰。
（5）镜检结束后，将镜头旋离玻片，立即清洁镜头。一般先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油滴。再用擦镜纸蘸少许(C2H5)20酒精混合液（2：3），擦去残留油迹，zui后再用干净的擦镜纸擦净（注意向一个方向擦拭）。

7．还原显微镜 关闭内置光源并拔下电源插头，或使反光镜与聚光器垂直。旋转物镜转换器，使物镜头呈八字形位置与通光孔相对。再将镜筒与载物台距离调至zui近，降下聚光器。罩上防尘罩，将显微镜放回柜内或镜箱中。

二、几种特殊的光学显微镜

（一）暗视野显微镜

        暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。操作者通过目镜观察到的，是检物体的衍射光图像（附图12）。

暗视野显微镜的基本使用方法如下：

1．安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。
2．选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。
3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。
4．进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图 2 中圆锥光束的顶点）对准待检物。
5．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。

（二）体视显微镜

体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为 110 mm）以及连续放大观看等特点。生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图 13）。

普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角体视角（一般为 12o15o），因而能形成三维空间的立体图像。体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。二者的主要区别在于：

1. 体视显微镜的镜检对象可不必制作成装片。
2. 体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可根据镜检的对象和要求加以选择。
3. 体视显微镜的成像是正立的，便于解剖操作。
4. 体视显微镜的物镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。

（三） 荧光显微镜

荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的荧光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发荧光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色，经紫外线照射后亦可发荧光（附图 1-4）。

荧光显微镜的原理为利用一个高发光效率的点光源（如超高压汞灯），经 过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650λ 或紫蓝光4200λ)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各色的荧光后，再通过物镜后面的阻断(或压制)滤光片的过滤，zui后经由目镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特定的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。

荧光显微镜按照光路原理可分为两种：

1．透射式荧光显微镜 较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。
2．落射式荧光显微镜 激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图 1-5)。

光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈 45o 角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。

（四）相差显微镜

          相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。人眼只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ（波长），如果再增加或减少 1/4λ，则光程差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差（见图 6）。

从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于：

1．环形光阑具有环形开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。
2．相位板相差显微镜在物镜内部增加了涂有氟化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位推迟 1/4λ。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。相位板按工作效果分为两种类型：

（1）A+相板：将直射光推迟 1/4λ，两组光波合轴后光波叠加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。
（2）B+相板：将衍射光推迟 1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本结构比周围介质更加暗淡，形成暗反差（或称正反差）。带有相板的物镜叫相差物镜，常在物镜外壳上标以“Ph”字样。

3．合轴调节望远镜

        相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在外壳上标有“CT”符号），用于调节环状光阑的像与相板共轭面*吻合，以便实现对直射光和衍射光的特殊处理。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，调节合轴调节望远镜的焦点，视野中会呈现两个圆环，分别是明亮的环状光阑圆环与较暗的相板上共轭面圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节螺旋，使两环*重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环*吻合。如果聚光器已升到zui高点或降到zui低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后即可取下合轴调节望远镜，换回目镜。

4．绿色滤光片

        用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整。相差显微镜的使用步骤如下：

① 根据待检标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。
② 将标本玻片放到载物台上，进行光轴中心的调整。
③ 使用合轴调节望远镜，调 整环状光阑与相板上的共轭面圆环*重叠吻合后，换回目镜。在观察过程中，每次更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。
④ 加绿色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。

（五）倒置显微镜

        倒置显微镜的结构和普通显微镜基本相同，只不过物镜与照明系统位置交换，前者在载物台之下，后者在载物台之上。主要用于观察培养的活细胞，需配制相差物镜。

（六）偏光显微镜

偏光显微镜可用于检测具有双折射性的物质，如染色体、胶原、纤维丝等（附图 1-7）

和普通显微镜不同的是：

① 偏光显微镜光源前配备偏振镜（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光。
② 镜筒中有检偏振镜（检偏器，一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器）。
③ 使用旋转载物台。当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。
④ 配备补偿器或相位片；
⑤ 使用无应力物镜。

三、电子显微镜

电子显微镜是利用高速运动的电子束来代替光波的一种显微镜。光学显微镜下只能清楚地观察大于 0.2 μm 的结构。而小于 0.2 μm 的结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些更为细微的结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，目前可达 0.2 nm，放大倍数可达 80 万倍。电子显微镜的基本要结构包括镜筒、真空系统和电源柜三部分。镜筒主要由电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，自上而下地装配成一个柱体；真空系统包括机械真空泵、扩散泵和真空阀门三部分，并通过抽气管道与镜筒相联接；电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。电子透镜是电子显微镜镜筒中的关键部件。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子枪的作用是发射并形成速度均匀的电子束，由灯丝（阴极）、栅极和阳极（加速极）构成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。使用中加速电压的稳定度要求不低于万分之一。电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。其中生物学研究中使用的是透射式和扫描式电子显微镜。前者常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；后者主要用于观察固体表面的形貌。

（一）透射式电子显微镜

透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的组件包括：

1. 电子枪 发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。
2. 聚光透镜 即电子透镜，将电子束聚集，可用于控制照明强度和孔径角。
3. 样品室 放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角度，还有装配加热、冷却等设备。
4. 物镜 为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。
5. 中间镜 为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。
6. 透射镜 为高倍的强透镜，用将二次放大后的中间像进一步放大后在荧光屏上成像。
7. 二级真空泵 对样品室抽真空。
8．照相装置 用以记录影像。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到zui后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为 50～100 nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。通常用薄切片法或冷冻蚀刻法制备：

（1）薄切片法 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金属盐染色，以增大反差。
（2）冷冻蚀刻法 亦称冰冻断裂法。将标本置于100?C 的干冰或196?C 的液氮中冰冻后，以冷刀急速断开标本。断裂的标本升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻完成后，向断面以 45o 角喷涂一层蒸气铂，再以90o 角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，称为复膜，能显示标本蚀刻面的形态。在电镜下观察得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。

（二）扫描式电子显微镜

          扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于 20 世纪 60 年代问世，目前分辨力可达 6～10 nm。其工作原理是由电子枪发射的精细聚焦电子束经两级聚光镜、偏转线圈和物镜射到样品上，扫描样品表面并激发出次级电子，次级电子的产生量与电子束入射角有关，即与样品的表面结构有关。次级电子经探测体收集后，由闪烁器转换为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。扫描电镜的标本在检验前，需进行固定、脱水处理，再喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。